Вич моноциты

Переезд склада в Европу.
Реализуем препараты от гепатита С в России по закупочной цене - ликвидация склада
Перейти на сайт

miRNA-1236 Inhibits HIV-1 Infection of Monocytes by Repressing Translation of Cellular Factor VprBP
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4059663/

Конкурирующие интересы: это исследование частично финансировалось с помощью стипендиальной программы Sanofi-Aventis-SIBS. Патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов не существует. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.

Задуманные и разработанные эксперименты: JW EC SX. Выполняли эксперименты: LM CS. Проанализированы данные: LM CS JW. Вклад в рукопись: JW EC.

Первичные моноциты невосприимчивы к инфекции ВИЧ-1 и становятся разрешительными при дифференцировке в дендритные клетки, полученные из моноцитов (MDDC) или макрофаги. Было предложено несколько механизмов для интерпретации ограничения ВИЧ-1 в моноцитах. Человеческие клеточные miRNAs могут модулировать ВИЧ-1-инфекцию, нацеливая либо на консервативные области генома ВИЧ-1, либо на генные транскрипты хозяина. Недавно мы сообщали о том, что трансляция белка хозяина белка-альфа подавляется обильными клеточными миРНК для ингибирования ВИЧ-1-инфекции в моноцитах. Здесь мы сообщаем, что транскрипт другого клеточного фактора, VprBP [Vpr (ВИЧ-1) -связывающего белка], был подавлен клеточной миРНК-1236, что способствует ограничению ВИЧ-1 в моноцитах. Трансфекция ингибиторов miR-1236 улучшала трансляцию VprBP в моноцитах и ​​значительно способствовала вирусной инфекции; экзогенный ввод синтезированных мириформ miR-1236 в MDDC подавляет трансляцию VprBP и, соответственно, значительно нарушает вирусную инфекцию. Наши данные подчеркивают роль miRNA в модуляции зависимой от дифференциации восприимчивости клетки-хозяина к инфекции ВИЧ-1. Понимание модуляции заражения ВИЧ-1 клеточной миРНК может обеспечить ключевые небольшие РНК или идентификацию новых важных белковых мишеней, регулируемых miRNAs для разработки противовирусных стратегий.

Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

miRNAs представляют собой небольшие некодирующие молекулы РНК (18-22 нуклеотидов), обнаруженные в эукариотических клетках. miRNAs являются жизненно важными посттранскрипционными регуляторами, а связывание miRNAs с 3′-нетранслированными областями на мишенях-мишенях мРНК обычно приводит к трансляционной репрессии или деградации мишени [1]. Аберрантная экспрессия miRNAs была вовлечена в развитие и прогрессирование многих инфекционных заболеваний, включая ВИЧ-1-инфекцию [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9 ]. Недавно были отмечены более высокие уровни miR-122 в сыворотке как потенциальные биомаркеры для неходжкинской лимфомы, связанной со СПИДом [10], и нарушенная экспрессия определенных miRNAs вирусом ВИЧ-1 или вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) в слизистой оболочке кишечника связана с нарушения эпителиального гомеостаза и кишечной энтеропатии [11].

Между тем, принимающие клеточные miRNAs могут модулировать ВИЧ-1-инфекцию путем нацеливания либо на консервативные области генома ВИЧ-1, либо на геном-транскрипты хозяина, и эти miRNAs могут играть решающую роль в поддержании вирусной латентности и развитии защиты хозяина [12], [13], [14]. Очевидно, что ВИЧ-1 nef является наиболее широко сфокусированным геном для изучения связывания с miRNAs. Высоко экспрессируемые клеточные miRNAs miR-125b, miR-150, miR-28, miR-223 и miR-382 репрессируют репликацию ВИЧ-1 путем нацеливания на 3f-длинноцепочечный повтор (LTR) и способствуют вирусной латентности в покои CD4 + Т-лимфоциты [15]. miR-29a специфически нацеливается на транскрипцию ВИЧ-1 nef и уменьшает вирусную продукцию и инфекционную активность, усиливает связь мРНК ВИЧ-1 с антагонистическими комплексами, индуцируемыми РНК, и секвестрами вирусной мРНК в P-телах для дальнейшей деградации [16], [17], [18 ], [19]. В силиконе изучали кластер из других miRNAs хозяина, таких как miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-224-3p, miR-223 и miR-24, и предсказал, что он связывается с ВИЧ-1 nef 3′-LTR [19]. В качестве альтернативы, некоторые miRNAs регулируют инфекцию ВИЧ-1 путем нацеливания на транскрипты гена хозяина. Дифференциальная регуляция клеточного miR-148 на аллелях HLA-C связана с контролем ВИЧ [20], [21]. Напротив, некоторые клеточные miRNAs хозяина, по-видимому, необходимы для ВИЧ-инфекции для установления инфекции. Клеточный miR-132 активируется в активированных CD4 + Т-клетках и потенцирует репликацию ВИЧ-1 путем нацеливания на хозяин-фактор MeCP2 (Methyl-CpG-связывающий белок 2) [22]. miR-217 и miR-34a, как сообщается, способствуют трансактивации, вызванной Tat-индуцированной ВИЧ-1 LTR, путем подавления SIRT1 (sirtuin 1), деацетилазы класса II, кодированной хозяином, [23], [24]. В последнее время новая miRNA miR-H3, кодируемая ВИЧ-1, была идентифицирована с помощью вычислительного прогнозирования и глубокого секвенирования. miR-H3 находится в области мРНК, кодирующей активный центр обратной транскриптазы, и нацеливается на ВИЧ-1 5′-LTR для повышения активности промотора и вирусной транскрипции [25]. Понимание этих ролей miRNA при репликации ВИЧ-1 будет полезно для выяснения опосредованного хозяином противовирусного ответа и изучения новых антивирусных стратегий.

Первичные моноциты невосприимчивы к инфекции ВИЧ-1 и становятся разрешительными при дифференцировке в макрофаги или дендритные клетки (DC) [26], [27], [28], [29]. Было показано, что множественная неэффективность в нескольких этапах после вступления в жизненный цикл ВИЧ-1, таких как обратная транскрипция, ядерный импорт доинтеграционного комплекса и вирусный перевод, несет ответственность за ограничение ВИЧ-1 в моноцитах [29], [30], [31], [32]. Ограничение ВИЧ-1 после вступления может быть связано с наличием потенциальных факторов ограничения или отсутствием зависящих от вируса факторов-хозяев. Низкое обилие тимидинфосфорилазы, который связан с ограниченным запасом дТТФ способствует огнеупорного ВИЧ-1 обратной транскриптазы [28], и обогащение факторов, ограничивающих хозяина, таких как APOBEC3G / F (аполипопротеина B мРНК-редактирования, фермент-каталитический, полипептид (например, 3G / F) [33] и SAMHD1 (домен SAM и белок, содержащий домен HD) 1) [34], [35], [36], [37] связаны с ограничением ВИЧ-1 в моноцитах или миелоидных клетках , Сообщалось также, что miRNAs модулируют ВИЧ-1-инфекцию в моноцитах [38], [39], [40]. Обилие miRNA-198 может подавлять экспрессию cyclin T-1 и ингибировать вирусную транскрипцию в первичных моноцитах [41].

Чтобы выявить ограничение репликации ВИЧ-1 miRNAs в недифференцированных моноцитах, мы проанализировали профиль экспрессии miRNA в моноцитах с помощью массива miRNA-chip и сравнили его с аналогами их дифференцированных моноцитов DC (MDDC). Недавно мы сообщали, что трансляция белка хозяина белка-альфа была подавлена ​​клеточными миРНК, чтобы ингибировать инфицирование ВИЧ-1 в моноцитах [39]. Здесь мы сообщаем, что другой фактор-хозяин, а именно VprBP, также может быть нацелен на клеточную миРНК для модуляции восприимчивости моноцитов / MDDC к инфекции ВИЧ-1.

Мы исследовали важность фактора VprBP хозяина при заражении ВИЧ-1. Мы экзогенно экспрессировали VprBP путем трансфекции pCMV-myc-VprBP в клетки HEK293T. Как и ожидалось, чрезмерная экспрессия VprBP, как было обнаружено вестерн-блоттингом, значительно увеличила инфицирование вируса ВИЧ-luc-Vpr + / везикулярного стоматита (VSV) -G дозозависимым образом (рис. 1A и B). И наоборот, сбивая экспрессию VprBP в клетках Magi / CCR5 со специфической siRNA VprBP, что подтверждается Вестерн-блоттингом (рис. 1C), нарушало заражение ВИЧ-luc-Vpr + / VSV-G (рисунок 1D). VprBP, по-видимому, продвигает пост-ядерное импортное событие ВИЧ-1 PIC (Pre-integration Complex), поскольку сбивание VprBP в клетках Magi / CCR5 не уменьшало продукты ВИЧ-1 как поздних обратных транскриптов (позднего RT), так и 2-LTR, а с другой стороны, сверхэкспрессия VprBP в клетках 293T существенно не улучшала продукцию как ВИЧ-1 Late RT, так и 2-LTR (данные не показаны). Эти данные показывают, что экспрессия VprBP важна для эффективной инфекции ВИЧ-1.

(A, B) Повышенная экспрессия VprBP способствует вирусной инфекции. Клетки HEK293T трансфицировали плазмидой CMV-myc-VprBP или пустым вектором в течение 2 дней, а затем инфицировали HIV-luc / VSV-G еще на 2 дня и измеряли вирусную инфекцию. Экзогенную экспрессию VprBP подтверждали вестерн-блоттингом. (C, D) Нокдаун VprBP ингибировал инфекцию ВИЧ-1. Ячейки Magi / CCR5 трансфицировали специфической или нецелевой миРНК и определяли экспрессию VprBP на уровне белка и вирусную инфекцию. Данные — среднее ± SD. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. * P

Чтобы еще раз продемонстрировать важность экспрессии VprBP в развитии инфекции ВИЧ-1, мы исследовали экспрессию VprBP в MDDC. VprBP показал адекватную экспрессию в MDDC по сравнению с моноцитами, как было обнаружено на уровне белка (рисунок 2A). Когда экспрессия VprBP в MDDC мешала специфическая siRNA (рис. 2B), инфекция псевдотипированного инфекционного ВИЧ-luc-Vpr + / VSV-G с одним циклом была значительно нарушена, что продемонстрировало решающую роль VprBP для эффективной инфекции ВИЧ-1 в первичной MDDC (рисунок 2C).

(A) экспрессия VprBP в MDDC и моноцитах была обнаружена вестерн-блоттингом. (B-D) Влияние сбивания VprBP на ВИЧ-1 инфекцию MDDC. MDDCs трансфицировали специфической siRNA 1 # и 2 # или мишенью с мишенью, а нокдаун VprBP был подтвержден вестерн-блоттингом через 48 ч после трансфекции (B); трансфицированные MDDC были инфицированы ВИЧ-luc / VSV-G в течение дополнительных 5 дней, и вирусная инфекция была обнаружена путем измерения активности люциферазы; Альтернативно, (C) трансфицированные клетки инфицировали в течение дополнительных 5 дней с помощью дикого типа или vpr-дефицитного репликации-компетентного HIV-1 / AD8, и репликацию вируса контролировали путем количественного определения p24gag в супернатанте культуры. Данные — среднее ± SD. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. * P

Считается, что VprBP плотно конъюгирован с Vpr для функционирования, например, ВИЧ-1 Vpr или ВИЧ-2 / SIVsmm / mac Vpx может взаимодействовать с VprBP и собираться с DDB1 (ДНК-связывающий ДНК-связывающий белок 1) с образованием E3-убиквитин-лигазы комплекс, который нацелен на клеточные субстраты для протеасом-опосредованной деградации и остановки клеточного цикла G2 [42], [43], [44]. Чтобы исследовать зависимость Vpr от VprBP-промотирующей инфекции ВИЧ-1, мы использовали Vpr-дефицитный ВИЧ-1. Усиленная репликация ВИЧ-1 наблюдалась только в Vpr-содержащих вирусах, а сбивание VprBP не ухудшало инфекцию VDR-дефицитного репликации-компетентного HIV-1 / AD8 в MDDC (рисунок 2D). Результаты показывают, что продвижение VprBP в инфекции ВИЧ-1 зависит от Vpr, и эти результаты также подтверждают зависимость VprBP от VPR-промотированной инфекции ВИЧ-1. Эти данные демонстрируют важность VprBP в инфекции ВИЧ-1 в MDDC и зависимость от Vpr вирусной инфекции, промотированной VprBP.

Мы показали выше, что VprBP не экспрессируется в моноцитах, как обнаружено на уровне белка (рисунок 2A). Для выяснения основного механизма репрессии экспрессии VprBP в первичных моноцитах была дополнительно оценена транскрипция VprBP. Неожиданно моноциты выражали еще более высокие уровни транскриптов мРНК VprBP, чем MDDC (рисунок 3A). Это указывает на посттранскрипционное ингибирование экспрессии VprBP в моноцитах.

(A) Относительный уровень мРНК VprBP в моноцитах по сравнению с MDDC. Полные клеточные РНК экстрагировали из клеток, а мРНК VprBP измеряли с помощью SEBR-полуколичественной ПЦР в реальном времени (RT-) на основе зеленого цвета и нормировали на -актин. (B) Последовательности miR-1236 и выравнивание с сохраняемым связующим положением 3′-UTR VprBP и относительная экспрессия miR-1236 в моноцитах по сравнению с MDDCs были количественно оценены с помощью miRNA RT-PCR от Bulge-loop. (C) Схематическая диаграмма, показывающая связывание miR-1236 на 3′-UTR мРНК VprBP и точечную мутацию сохраненных положений целевых последовательностей. (D) Ингибирование miRNA имитирует экспрессию pGL3cM, содержащей фрагмент 3′-UTR мРНК VprBP или мутант в положении консервативного связывания. Данные — среднее ± SD. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. * P

Учитывая регуляторную роль miRNA при трансляции, мы сравнили экспрессию miRNA в моноцитах и ​​MDDC с помощью массива Agilent miRNA-chip. Целевое предсказание miRNAs и выравнивание miRNAs с целевыми последовательностями достигалось с использованием TargetScan. Мы обнаружили, что 17-24 базы VprBP 3′-UTR были нацелены на hsa-miR-1236. Экспрессия miR-1236 была проверена с использованием наборов Primer S-образных микрограмм miRNA серии Bulge. Выражение было скорректировано на основе малой транскрипции ядерной РНК U6. Экспрессия miR-1236 значительно улучшалась в моноцитах по сравнению с MDDC (рис. 3B).

Для подтверждения нацеливания мРНК 3′-UTR VprBP на miRNA-1236 фрагменты 3′-UTR млекопитающих VprBP, которые содержали положения консервативного связывания, были клонированы в pGL3cM, а мутации введены в положениях консервативного связывания VprBP 3′-UTR для уменьшения спаривания Watson-Crick с miRNAs (рис. 3C). Ингибирование трансфицированных миРНК миРНК на экспрессию pGL3cM-содержащих 3′-UTR-фрагментов VprBP или мутантов количественно определяли с использованием системы репортерной системы с двумя люциферазами и рассчитывали относительную активность светлячков и люмифераз Рениллы. Трансфекция мимикой miRNA значительно ингибировала экспрессию pGL3cM / VprBP 3′-UTR, а мутация консервативных позиций связывания отменяет ингибирование, опосредованное мимиками miRNA (рисунок 3D). Эти данные показали, что miR-1236 нацеливает VprBP мРНК 3′-UTR для репрессии в моноцитах.

ВИЧ-1-инфекция была ограничена в первичных моноцитах, но это ограничение можно было частично облегчить, когда моноциты были дифференцированы в DC при стимуляции цитокинами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и интерлейкина-4, что подтверждено на рисунке 4A. Было показано несколько причин для выявления зависимой от дифференциации восприимчивости моноцитов к инфекции ВИЧ-1 [29], [30], [31], [32], [39].

(A) Сравнение заражения ВИЧ-luc / VSV-G в MDDC по сравнению с моноцитами. (B, C). Трансфекция моноцитов ингибитором miR-1236 способствовала трансплантации VprBP и значительно усиливала инфицирование ВИЧ-luc / VSV-G. (D, E). Трансфекция MDDC с miR-1236 имитирует нарушенный перевод VprBP и значительно ингибирует заражение ВИЧ-luc / VSV-G. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. Данные — среднее ± SD. *** P

Учитывая важную роль VprBP в продвижении инфекции ВИЧ-1 и регулирование трансляции VprBP miR-1236, нас интересовало, является ли miR-1236 модулированная восприимчивость моноцитов / MDDC к инфекции ВИЧ-1. Мы трансфицировали моноциты химически синтезированными однонитевыми ингибиторами miRNA. Как показано на фиг.4В и С, трансфекция ингибиторов miR-1236 улучшала трансляцию VprBP в моноцитах и ​​значительно способствовала заражению ВИЧ-Luc / VSV-G. Дополни- тельно, когда химически синтезированные мимики miR-1236 трансфицировали в MDDC, трансляция VprBP была подавлена ​​(рис. 4D), и соответственно инфекция MDDCs ВИЧ-Luc / VSV-G значительно уменьшилась (рис. 4Е). Эти данные показывают, что опосредованная miR-1236 регуляция экспрессии VprBP модулирует дифференцируемую зависимую восприимчивость моноцитов / MDDC к инфекции ВИЧ-1.

ВИЧ-1 зависит от факторов, кодируемых хозяином-клеткой, для завершения его жизненного цикла, а сотни генов-хозяев, зависящих от ВИЧ-1, для репликации были обнаружены путем равномерного проведения в клетках-мишенях, не относящихся к естественной биологии ВИЧ-1 или клеточных линий [45 ], [46], [47]. Принимая более физиологически релевантные первичные клетки, мы проводили скрининг экспрессии генов в моноцитах с помощью анализа микроматрицы мРНК и miRNA и сравнивали его с таковым в своих дифференцированных MDDC [39]. Наша цель заключалась в том, чтобы в широком масштабе определить гены, выраженные по-разному, которые могли бы модулировать восприимчивость к ВИЧ-1 в моноцитах / MDDC.

VprBP, также известный как DCAF1 (DDB1-CUL4-ассоциированный фактор 1), является компонентом, который образует комплекс лигатинов CUL4-DDB1-VprBP / DCAF1 E3 ubiquitin. В качестве связующего белка Vpr VprBP плотно конъюгирован с Vpr для функционирования [48], [49]. Здесь мы продемонстрировали, что VprBP и Vpr проявили взаимную зависимость в продвижении инфекции ВИЧ-1, хотя подробные механизмы необходимо уточнить.

VprBP функционирует как модуль распознавания субстрата в комплексе CUL4-DDB1-VprBP / DCAF1 E3 ubiquitin protein ligase и мостирует целевые белки к DDB1. ВИЧ-1 Vpr или HIV-2 / SIVsmm / mac Vpx может взаимодействовать с VprBP и собираться с DDB1 с образованием комплекса E3 ubiquitin ligase, который нацелен на клеточные субстраты для опосредованной протеасомой деградации и остановки клеточного цикла G2 [42], [43 ], [44], [50]. Недавнее исследование показало, что прямое взаимодействие ВИЧ-1 Vpr со структурно-специфическим регулятором эндонуклеазы SLX4 рекрутирует VprBP и киназоактивный PLK1 и усиливает расщепление ДНК с помощью SLX4-ассоциированных эндонуклеаз MUS81-EME1, что приводит к остановке G2 / M [ 51]. Кроме того, комплекс DDB1-Cul4-DCAF1 / VprBP E3 ubiquitin ligase представляется необходимым для опосредованной V1 ВИЧ-расщеплением гликозилаз урацил-ДНК 2 и SMUG1 (одноцепочечно-селективная монофункциональная урацил-ДНК-гликозилаза 1) [52]. Сообщалось, что DCAF1 / VprBP набирается ВИЧ-2 / SIVsmm / mac Vpx для захвата комплекса лигида-убихитина лития CUL4-DDB1 E3 для деградации ограничивающего хозяина фактора SAMHD1 [34], [35], [53], облегчающего ВИЧ-1 в миелоидных клетках. Тем не менее, SAMHD1 показывает сравнимую экспрессию в моноцитах по сравнению с MDDC, что свидетельствует о том, что VprBP-облегченная инфекция ВИЧ-1 в MDDC не связана с деградацией SAMHD1, индуцированной комплексом CUL4-DDB1-DCAF1 / VprBP E3 ubiquitin protein ligase.

В нашем микроРНК-чип-анализе мы также обнаружили, что другие клеточные miRNAs, такие как miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-93, miR-106b и miR-20a, могут ингибировать инфицирование ВИЧ-1 в моноцитах, и Pur-alpha, транскрипционный фактор, кодируемый хозяином-клеткой, необходимый для усиления трансактивации вируса Tat, был нацелен на репрессию в моноцитах [39].

Таким образом, наши результаты показывают, что фактор хозяина VprBP был нацелен на клеточный miR-1236 для модуляции зависимой от моноцитов / MDDC восприимчивости к инфекции ВИЧ-1. разрабатываются методы, основанные на miRNA, и понимание модуляции заражения ВИЧ-1 клеточными миРНК может обеспечить ключевые небольшие РНК или идентификацию новых важных белковых мишеней, регулируемых miRNAs для антивирусных терапевтических вмешательств.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) от здорового донора были приобретены в Центре крови Шанхая (Шанхай, Китай). CD14 + моноциты выделяли из РВМС с помощью магнитных гранул с покрытием CD14 (Miltenyi Biotec, Германия), как описано ранее [54]. Моноциты дифференцировали в MDDC путем стимуляции 50 нг / мл GM-CFS и IL-4 в течение 6 дней. Клеточная линия HEK293T была любезно предоставлена ​​доктором Ли Ву (Университет штата Огайо, Колумб, Огайо, США) и клеточной линией клеток Magi / CCR5, полученной HeLa-клеткой [39], был подарком от доктора Пола Чжоу (Институт Пастера Шанхая , Китайская академия наук, Шанхай, Китай).

Одноциклический ВИЧ-Luc / VSV-G был продуцирован путем ко-трансфекции, опосредованной кальций-фосфатом клеток HEK293T, с провирусным вектором люциферазы-репортера HIV-1 NL-Luc-E-R + (Vpr +) и экспрессирующей плазмидой везикулярного стоматита вирус G (VSV-G). Реплицирующий компетентный вирус ВИЧ-1-AD8 (R5-троп) или вирус V8 делеции вируса Vpr был получен путем трансфекции векторов ВИЧ-1 pNLAD8 или pNLAD8-ΔVpr, соответственно. Плазмиды любезно предоставили доктор Ли Ву (Университет штата Огайо, Колумб, штат Огайо, США). Собранные супернатанты, которые содержали вирусные частицы, фильтровали и количественно определяли с помощью ELISA с захватом p24gag. Клетки инфицировали HIV-1-Luc / VSVG (1 нг p24gag) или репликации компетентного HIV-1 (1 нг p24gag) в течение 2 часов, а после промывания клетки дополнительно культивировали в течение 2 дней (клеточная линия) или 5 дней ( MDDC и моноциты). Вирусная инфекция была обнаружена путем измерения активности люциферазы из клеточных лизатов или определения уровня p24gag из супернатанта. Специфические моноклональные антитела к ВИЧ-1 p24gag являются любезным подарком профессора Юн-Тан Чжэн из Института зоологии Китая Куньмин, Китайской академии наук.

Клетки трансфицировали Lipofectamine 2000 (Invitrogen) с помощью плазмид pCMV-myc / pCMV-myc-VprBP или со специфической дуплексной сиРНК VprBP или контрольной группы (GenePharma, Shanghai, China) или с ингибитором miR-1236 или имитацией (GenePharma). Затем клетки собирали для определения состояния экспрессии путем Вестерн-блоттинга или для вирусной инфекции, как описано выше. Последовательности двухнуклевых ингибиторов siRNA, ингибиторов miRNA и имитаций были следующими: VprBP siRNA 1 # 5′-GGCCCAGAUAACCGAAUAUTT-3 ‘, VprBP siRNA 2 # 5′-GCGACUCAUUC UCCAAUAUTT-3’. Плазмида pCMV-myc-VprBP, кодирующая полноразмерный myc-tagged VprBP (также известный как DCAF1), была описана ранее [50]. Для Вестерн-блоттинга использовали антимиксовое моноклональное антитело (клон 19C2, Abmart, Shanghai, China) и кроличьего поликлонального антитела против VprBP (Santa cruz, America).

Профили экспрессии мРНК и miRNA при дифференцировке моноцитов в DC подвергали скринингу с помощью матрицы Affymetrix U133 plus 2.0 и матрицы экспрессии miRNA Agilent, как описано ранее [39], соответственно. Гены были проанализированы далее онлайн с помощью инструмента функциональной аннотации в DAVID Bioinformatics Resources 6.7 (Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальный институт здравоохранения США, Bethesda, MD, США). Целевое предсказание miRNAs и выравнивание miRNAs с целевыми последовательностями выполнялось с использованием TargetScan (http://www.targetscan.org). Экспрессия miRNAs была проверена с помощью наборов праймеров PMR QRT-PCR Bulge-loop (RiboBio Corp, Guangzhou, China). Выражение было скорректировано на основе малой транскрипции ядерной РНК U6, и была рассчитана относительная экспрессия miRNA указанных контролей. ПЦР проводили в системе ПЦР реального времени ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

VTRBP 3 ‘UTR амплифицировали из общей РНК, экстрагированной из клеточной линии HEK293. Связывающие сайты VTRBP 3 ‘UTR для miR-1236 были синтезированы следующим образом: 5′-CGGAGCCATCACTGCTTGGAAGAGATTCTTGGCAGAGAGAGAAGAGGGGACAA-3′ (forward), 5’-GATCTTGTCCCCTC TTCTCTCTGCCAAGAATCTCTTCCAAGCAGTGATGGCTCCGAGCT-3 ‘(обратный). И точечные мутации консервативных сайтов связывания VprBP 3′-UTR для miR-1236 были синтезированы следующим образом: 5’-CGGAGCCATCACTGCTTAACGA CAGTTCTTGGCAGAGAGAAGAGGGGACAA-3 ‘(forward), 5′-GATCTTGTCC CCTCTTCTCTCTGCCAAGAACTGTCGTTAAGCGTGATGGCTCCGAGCT-3’ (обратный). Репортер связывания MiRNA pGL3CM-VprBP-3’UTR или мутация была сконструирована с Bgl II и Sac I. Плазмида pGL3CM любезно одарена доктором Ke Lan (Институт Пастера Шанхая, Китайская академия наук, Шанхай, Китай).

Для анализа эффектов miRNAs на их гены-мишени, как описано ранее [2], использовали систему анализа репортерной системы с двумя люциферазами (Promega, Madison, WI, USA). Вкратце, репортерные плазмиды pGL3CM (100 нг) были совместно трансфицированы в клетки HEK293T с miR-1236 (1 мкл) или с контрольной точки зрения и 10 нг pRL-TK. Липофектамин 2000 использовали для трансфекции. Клетки собирали для анализа люциферазы через 48 ч после трансфекции и лизировали 100 мкл 1 × отрицательного лизисного буфера (Promega) в течение 15 мин; Лизат (20 мкл) добавляли с буфером для анализа люциферазы и смешивали для измерения люциферазы светлячков на люминометре Veritas (Turner BioSystems, Саннивейл, Калифорния, США). Затем добавляли Stop & Glo Reagent (30 мкл) и смешивали для обнаружения люциферазы рениллы.

Статистический анализ проводился с использованием парного теста t с SigmaStat 2.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA).

Мы с благодарностью благодарим доктора Ли Ву, профессора Юн-Тан Чжэн и доктора Пола Чжоу за подарки от плазмид, антител или клеточных линий.



Источник: rupubmed.com