Hbv днк что это

Переезд склада в Европу.
Реализуем препараты от гепатита С в России по закупочной цене - ликвидация склада
Перейти на сайт

Development of a new ultra sensitive real-time PCR assay (ultra sensitive RTQ-PCR) for the quantification of HBV-DNA
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2848214/

Повышенная чувствительность тестов HBV-ДНК имеет решающее значение для лечения инфекции HBV. Наша цель состояла в том, чтобы разработать и оценить новый ультрачувствительный собственный PCR-анализ в реальном времени для количественной оценки HBV-ДНК (ультрачувствительный RTQ-PCR).

Ранее используемые стандарты HBV-ДНК были откалиброваны в соответствии с первым международным стандартом ВОЗ для HBV-ДНК (OptiQuant® HBV-DNA Quantification Panel, Accrometrix Europe B.V.). Конечная точка обнаружения 95% и 50% HBV-ДНК была 22,2 и 8,4 МЕ / мл. Согласно результатам калибровки, 1 МЕ / мл равно 2,8 копий / мл. Важно отметить, что клиническая эффективность ультрачувствительной ПЦР в реальном времени была протестирована аналогично (67%) на дискриминационный тест HBV Procleix Ultrio (dHBV) (70%) в образцах с низким титром у пациентов с оккультным гепатитом B. Наконец, при сравнении ультрачувствительной RTQ-ПЦР с коммерчески доступным тестом COBAS TaqMan HBV, собственный анализ выявил 94,7% из 94 образцов как положительных по сравнению с 90,4%, идентифицированных TaqMan, тогда как количественные результаты, которые были положительными с помощью обоих анализов, были сильно коррелированы ( r = 0,979).

Мы сообщаем о новом ультрачувствительном анализе на основе молекулярного маяка с ПЦР в реальном времени с замечательной аналитической и клинической чувствительностью, откалиброванной против первого международного стандарта ВОЗ.

Хроническая инфекция вирусом гепатита В (HBV) может быть оценена путем оценки клинических признаков и биохимических, вирусологических и гистологических параметров. Знание вирусной нагрузки HBV-ДНК полезно для прогнозирования прогноза болезни, определения инфекционности, оценки показаний к лечению, оценки реакции на лечение с выявлением возникновения резистентности и диагностики оккультной инфекции HBV [1-5].

Существует несколько коммерчески доступных тестов HBV-ДНК. Самые старые версии страдали низкой чувствительностью (примерно 5 · 105 копий / мл) и узким динамическим диапазоном количественной оценки HBV-ДНК (~ 3-4 log10), тогда как текущий предел обнаружения новых анализов ниже 50 МЕ / мл с динамическим диапазоном приблизительно 8 log10 [6-13]. Кроме того, было разработано несколько собственных количественных анализов для HBV-ДНК, основанных главным образом на методах ПЦР в реальном времени, демонстрирующих замечательную чувствительность и широкий линейный диапазон для количественной оценки [6,7,11-14].

Важно отметить, что повышенная чувствительность тестов HBV-ДНК имеет решающее значение для лечения инфекции HBV, а также для диагностики оккультной инфекции HBV [HBsAg (-), HBV-DNA (+)] [15].

Цель этого исследования заключалась в разработке нового ультрачувствительного анализа ПЦР в реальном времени на основе ноу-хау существующего анализа ПЦР в реальном времени для количественной оценки HBV-ДНК [12], а также для оценки его рабочих характеристик.

ДНК HBV экстрагировали из 0,5 мл сыворотки / плазмы с использованием набора вируса QIAamp UltraSens (QIAGEN Inc., Valencia CA) и ДНК элюировали в 60 мкл буфера для элюирования. Для каждого ультрачувствительного измерения квантования ДНК HBV-RTQ-PCR положительный образец HBV-ДНК с известным титром HBV-ДНК (~ 104 МЕ / мл) и один отрицательный контроль (отрицательная человеческая плазма) (отрицательный калибратор Procleix®, Chiron / GenProbe , CA) были извлечены дополнительно к неизвестным образцам.

Анализ проводили в аппарате LightCycler® 2.0. Реакционная смесь содержала 1 × реакционный буфер (LightCycler DNA Master HybProbe, Roche Applied Science, Германия), 5 мМ MgCl2, 0,5 мкМ праймера hbv305 (смысл) 5′-GCCAAAATTCGCAGTCCC-3 ‘, 0,5 мкМ праймера hbv460 (антисмысловой) 5’- GATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAG-3 ‘, 0,4 мкМ молекулярного маяка 5′-CGCGCGATGAGGCGCAGG-3′, меченного FAM и Dabcyl на 5′- и 3’-концах, соответственно, ДНК-полимеразу Taq, смесь dNTP (с dUTP вместо dTTP) и 1 U uracil-ДНК-гликозилаза (Roche Applied Science, Германия). Профиль амплификации был следующим: Один цикл начальной денатурации (95 ° С в течение 10 мин), а затем 40 циклов амплификации при 95 ° С в течение 0 с, 55 ° С в течение 10 секунд и при 72 ° С в течение 8 сек. Конечный реакционный объем составлял 60 мкл, содержащий 30 мкл экстрагированной вирусной ДНК.

Чувствительность вместе с 95% и 50% -ными пределами обнаружения HBV-ДНК для анализа оценивали с использованием первого международного стандарта ВОЗ для HBV-ДНК (OptiQuant® HBV-DNA Quantification Panel, Accrometrix Europe B.V.), протестированного в 8 репликах. Мы проводили серийные разведения с отрицательной плазмой человека (Procleix® Negative Calibrator, Chiron / GenProbe, CA) стандарта ВОЗ при конечных концентрациях 100, 50, 25, 10 и 5 МЕ / мл. Пределы обнаружения ДНК на 95% и 50% HBV были рассчитаны методом пробит-анализа (8 реплик).

Клинические показатели анализа были проверены на 27 образцах, взятых у 22 особей с оккультным гепатитом B (отрицательный HBs Ag, последовательно реагирующий на мультиплексный Procleix Ultrio HIV-1 / HCV / HBV и Procleix Ultrio, дискриминационный ВИЧ и отрицательный HCV), скрининг с дискриминационным HBV-анализ (dHBV) (Chiron / GenProbe, Emeryville / San Diego, CA).

Калибровку значений HBV-ДНК проводили против первого международного стандарта ВОЗ для HBV-ДНК (OptiQuant® HBV-DNA Quantification Panel, Accrometrix Europe B.V.). В частности, серийные разведения стандарта ВОЗ в диапазоне от 2 · 102 до 2 · 106 МЕ / мл) в 5 отдельных препаратах образцов были протестированы с помощью ультрачувствительного метода RTQ-PCR. На основе линейной регрессии была рассчитана формула преобразования для внутренних измерений (копий / мл) в международные стандартные единицы (МЕ / мл).

Чтобы сравнить ультрачувствительный анализ RTQ-PCR с ранее сообщенным тестом, ДНК HBV, полученную из 25 случайно выбранных образцов, определяли количественно с использованием обоих методов. Была также оценена корреляция количественных показателей HBV-ДНК с использованием текущего и предыдущего внутреннего анализа.

Для сравнения ультрачувствительного анализа RTQ-PCR с коммерчески доступным тестом COBAS TaqMan HBV были испытаны образцы плазмы, собранные у 94 различных пациентов с HBV-инфицированным. Была также оценена корреляция количественных показателей HBV-ДНК с использованием внутреннего и коммерческого теста.

Коэффициент корреляции Пирсона использовался для оценки прочности линейной связи между log10-преобразованными значениями оцененных (копий / мл) по сравнению с ожидаемыми значениями (IU / mL), а также между количественными коэффициентами HBV-ДНК с использованием двух внутренних реальных данных, ПЦР-анализ и COBAS TaqMan. Чтобы сравнить количественные результаты, полученные для образцов, обнаруженных положительными с помощью двух разных методов (ультрачувствительный RTQ-PCR против теста COBAS TaqMan HBV), установленную линию регрессии сравнивали с линией равенства, проверяя двухстороннюю гипотезу наклона = 1 и перехват = 0.

Ультрачувствительный RTQ-PCR проводили в аппарате LightCycler® 2.0 с использованием стандартного плазмидного HBV-ДНК, как описано ранее. Следует отметить, что специфичность анализа составляла 100%, как показано ранее [12]. Различия между недавно разработанным методом (ультрачувствительным RTQ-PCR) и предыдущим [12] были: 1) использование молекулярного маяка вместо 2 гибридизационных зондов, 2) экстракция HBV-ДНК из большего объема сыворотки / плазма (0,5 против 0,2 мл), 3) использование 30 мкл вместо 10 мкл экстрагированной ДНК, 4) модифицированных условий RTQ-PCR и 5) все эксперименты проводились в аппарате LightCycler® 2.0, поскольку последний показывает улучшенные рабочие характеристики по сравнению с LightCycler® 1.0. Кроме того, объем реакции в LightCycler® 2.0 может составлять до 100 мкл по сравнению с 20 мкл в LighCycler® 1.0.

Для определения аналитической чувствительности ультрачувствительной RTQ-ПЦР были испытаны 5 разведений 1-го международного стандарта ВОЗ для ДНК HBV (OptiQuant® HBV-DNA Quantification Panel, Accrometrix Europe B.V.). Концентрации ДНК выше 25 МЕ / мл были обнаружены во всех 8 случаях; концентрации 10 МЕ / мл тестировали 4 раза в 8 раз (50%), а 5 МЕ / мл были обнаружены в 2 из 8 случаев (25%). Конечная точка обнаружения 95% и 50% составила 22,2 и 8,4 МЕ / мл соответственно.

Результаты анализа были проверены на 27 образцах, собранных у 22 особей с оккультным гепатитом B (отрицательный HBsAg, HBV-ДНК, последовательно реагирующий на Ultrio, Ultrio HIV и HCV-отрицательный). Этот анализ был частью другого исследования, касающегося молекулярной типизации оккультного гепатита B у доноров крови по всей Греции [15]. Характеристики этих пациентов показаны в таблице 1. Эти образцы были выбраны из-за низкого титра HBV-ДНК. Среди 27 образцов, прошедших тестирование с помощью теста dHBV, было обнаружено, что 19 (70%) были выше порога обнаружения, в то время как аналогичная чувствительность наблюдалась для ультрачувствительного метода RTQ-PCR (18 образцов испытали положительный результат из 27, 67% ). Средняя HBV-ДНК составляла 59,1 МЕ / мл (диапазон от 10,2 до 346,7 МЕ / мл). Следует, однако, отметить, что анализ dHBV применялся несколько раз до 18 образцов (образец считался положительным, если он был проверен выше порога обнаружения хотя бы один раз), тогда как ультрачувствительная RTQ-ПЦР выполнялась только один раз. Как показано в таблице 2, 14 образцов были обнаружены обоими методами, тогда как 4 и 5 образцов были испытаны положительно только с помощью ультрачувствительной RTQ-PCR и теста dHBV, соответственно. Эти качественные данные свидетельствуют о том, что внутренний анализ выполнялся одинаково хорошо, как коммерческий тест, хотя образцы были проверены несколько раз по последнему методу.

Эпидемиологические, молекулярные и серологические особенности 27 образцов, полученных от 22 доноров крови с оккультной инфекцией гепатита В *

1dHBV: Procleix Ultrio дискриминационный тест HBV

* Всеми субъектами были HBsAg (-) / HBeAg (-) / IgG-анти-HBc (+)

Эффективность ультрачувствительных RTQ-PCR и HBV Procleix Ultrio дискриминирующих тестов HBV (dHBV) на 27 образцах, собранных у 22 особей с оккультным гепатитом B

Калибровку внутреннего анализа проводили против 1-го международного стандарта ВОЗ для ДНК HBV-ДНК (OptiQuant® HBV-DNA Quantification Panel, Accrometrix Europe BV), и ДНК HBV тестировали в 5 повторах с использованием плазмидной ДНК как стандарт. Схема корреляции ожидаемого (log10 HBV-ДНК IU / mL) по сравнению с оценочными значениями ультрачувствительной RTQ-PCR log10 HBV-ДНК-копий / мл) показана на рисунке 1. Установленные линии регрессии между IU / mL и копиями / мл давали следующим уравнением: log10 (IU / mL) = -0,4475 + 1,0096 · log10 (ультрачувствительные RTQ-PCR копии / мл), что указывает на то, что в нашей установке 1 МЕ / мл = 2,8 копии / мл. 95% ДИ для предполагаемого перехвата составлял -0,69, -0,21. 95% ДИ для оцененного склона составлял 0,96, 1,06. Коэффициент корреляции между ожидаемым и оценочным значениями был очень хорошим r = 0,9937 (p

Калибровка значений HBV-ДНК с использованием ультрачувствительного анализа RTQ-PCR по сравнению с Международными единицами ВОЗ. Корреляционный график ожидаемого (log10 HBV-ДНК IU / mL) по сравнению с оцененными значениями ультрачувствительной RTQ-PCR (log10 HBV-ДНК-копии / мл), испытанный на 5 последовательных концентрациях Международного стандарта ВОЗ в диапазоне от 2 × 102 -2 × 106 МЕ / мл с использованием плазмидной ДНК в качестве стандарта.

Чтобы оценить корреляцию между предыдущим и новым анализом, мы повторно протестировали 25 ранее квантованных образцов. Средняя log10 HBV-ДНК составляла 5,38 копий / мл (диапазон от 2,31 до 10,51 log10 копий / мл). Важно отметить, что линейность была очень хорошей между значениями HBV-ДНК, количественно определяемыми двумя анализами (r = 0,985, p

Среди 94 образцов, испытанных с тестом TaqMan, 85 (90,4%) оказались выше порога обнаружения, в то время как более высокая чувствительность наблюдалась для ультрачувствительного метода RTQ-PCR (89 образцов испытали положительный результат из 94, 94,7% ). Как показано в таблице 3, 83 образца (88,3%) были обнаружены обоими методами, в то время как 6 (6,4%) и 2 (2,1%) образца были испытаны положительно только с помощью ультрачувствительной RTQ-PCR и теста TaqMan соответственно. Эти качественные данные свидетельствуют о том, что новая версия внутреннего анализа была одинаково хорошо реализована, как коммерчески доступный тест TaqMan (значение McNemar p = 0,157). Внутренний анализ обнаружил положительные шесть образцов (от 1,37 до 1,83 log10 МЕ / мл) с неопределяемыми уровнями вирусной нагрузки с помощью теста COBAS TaqMan HBV, в то время как он не определял количественно два образца (с уровнями вирусной нагрузки 1,08 и 1,77 log10 МЕ / мл , соответственно).

Эффективность ультрачувствительного теста RTQ-PCR и COBAS TaqMan на 94 случайно выбранных образцах с гепатитом B

На фиг.2 показан график рассеяния log10 HBV-ДНК IU / mL, определяемый ультрачувствительными RTQ-PCR и анализами TaqMan, с использованием образцов с детектируемой ДНК HBV с помощью обоих анализов (N = 83). Результаты двух анализов линейно коррелировали (r = 0,979, p

Сравнение значений HBV-ДНК, оцененных с использованием теста COBAS TaqMan и ультрачувствительной RTQ-PCR. Корреляционный график log10 HBV-ДНК IU / mL, определяемый с помощью ультрачувствительного теста RTQ-PCR и COBAS TaqMan Test в 83 образцах, детектируемых с помощью обоих анализов. Накладывается линия, установленная на регрессию (прерывистая линия) и линия равенства (диагональная постоянная линия).

Чувствительное обнаружение и количественное определение HBV-ДНК имеет важное значение для мониторинга реакции на терапию, а также для оценки оккультной инфекции HBV. Поэтому в клинической практике необходимы ультрачувствительные анализы для количественной оценки HBV-ДНК.

В настоящем исследовании мы описываем характеристики новой ультрачувствительной внутренней RTQ-PCR, выполненной в приборе LightCycler® 2.0 (Roche, Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Новый анализ показал улучшенную чувствительность 22 и 8 МЕ / мл как 95% и 50% контрольных точек соответственно, по сравнению с 94 МЕ / мл (250 копий / мл) ранее сообщенного количественного теста [12]. Чувствительность анализа улучшалась главным образом из-за большего объема HBV-ДНК, используемой в ультрачувствительной RTQ-PCR, экстрагированной также из большего объема сыворотки / плазмы. Кроме того, новый анализ был проведен в LightCycler® 2.0, который показывает улучшенные характеристики, чем LightCycler® 1.0. Следует отметить, что чувствительность анализа может быть потенциально улучшена за счет использования плазмы более 0,5 мл после стадии концентрации, проводимой до стандартной процедуры. Более того, стандарт плазмиды, откалиброванный в соответствии с первым международным стандартом ВОЗ, тем самым указывает на то, что значения HBV-ДНК сообщаются в международном формате (МЕ / мл).

Важно отметить, что ультрачувствительная RTQ-ПЦР выполнялась одинаково хорошо, как качественный анализ dHBV, протестированный на образцах HBV-ДНК с низким титром, собранных у людей с оккультным гепатитом B. Эти результаты соответствуют ранее зарегистрированному пределу обнаружения вируса dHBV, 19 МЕ / мл [16], что почти идентично пределу обнаружения 95% (22 МЕ / мл) ультрачувствительного анализа RTQ-PCR. Эти данные свидетельствуют о том, что ультрачувствительный анализ RTQ-PCR одинаково надежен как dHBV для обнаружения HBV-ДНК в образцах с низким титром, как у пациентов с оккультным гепатитом B. Следует отметить, однако, что ультрачувствительная RTQ-ПЦР является и поэтому его не следует использовать для диагностических целей.

Количественные значения HBV-ДНК между ультрачувствительной RTQ-PCR и ранее описанным тестом HBV-ДНК коррелировали очень хорошо, предполагая, что новая версия теста может быть использована в случаях, когда использовался оригинальный тест. Кроме того, было установлено, что ультрачувствительная RTQ-PCR сильно коррелирует с коммерчески доступным тестом COBAS TaqMan HBV (r = 0,979, p

В эпоху высокоэффективных противовирусных препаратов (например, тенофовир, энтекавир), одобренных для лечения хронического гепатита В, крайне важно использовать высокочувствительные анализы для выявления и количественного определения ДНК HBV. Мы сообщаем о новом ультрачувствительном анализе с использованием молекулярного маяка в качестве системы обнаружения с замечательной аналитической и клинической чувствительностью, откалиброванной против первого международного стандарта ВОЗ.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

ДП участвовал в разработке и координации исследований, он подготовил рукопись и ответ на комментарии рецензента; AB и CH провели эксперименты; AK, ZM, HH, AV были ответственны за часть исследования, касающегося оккультной инфекции гепатита B; VS сделал статистический анализ; AH был координатором исследования и участвовал в написании и редактировании рукописи. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Это исследование было поддержано Галаадом. DP, AK, HH и VS были поддержаны Греческим центром по контролю за инфекционными заболеваниями (HCIDC) Министерства здравоохранения и социального обеспечения.



Источник: rupubmed.com